SDHD Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403276-ACT

O SDHD humano codifica a pequena subunidade integral de membrana D da succinato desidrogenase (complexo II mitocondrial), um componente central que ancora o domínio catalítico da SDH na membrana interna da mitocôndria e sustenta a transferência de elétrons do succinato para a ubiquinona. Ao ligar o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) à cadeia respiratória, o SDHD contribui para a fosforilação oxidativa, o equilíbrio redox celular e a homeostase de metabólitos, incluindo a regulação dos níveis de succinato. A disrupção ou expressão alterada de SDHD pode promover disfunção mitocondrial e acúmulo de succinato, remodelando a sinalização por vias de detecção de oxigênio e resposta ao estresse, como programas transcricionais relacionados ao HIF. O SDHD tem forte relevância em doença na biologia de tumores com deficiência de SDH e na desregulação metabólica mitocondrial, tornando-se um alvo-chave para estudar relações entre genótipo e metabolismo.

SDHD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SDHD sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SDHD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SDHD em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SDHD, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SDHD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SDHD nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SDHD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SDHD em células tumorais com expressão de SDHD silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.