SDHD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403276-ACT

Das menschliche SDHD-Gen kodiert die kleine integrale Membranuntereinheit D der Succinatdehydrogenase (mitochondrialer Komplex II), eine zentrale Komponente, die die katalytische SDH-Domäne in der inneren Mitochondrienmembran verankert und den Elektronentransfer von Succinat auf Ubichinon unterstützt. Durch die Verknüpfung des Tricarbonsäure-(TCA-)Zyklus mit der Atmungskette trägt SDHD zur oxidativen Phosphorylierung, zum zellulären Redoxgleichgewicht und zur Metabolitenhomöostase bei, einschließlich der Regulation der Succinatspiegel. Eine Störung oder veränderte Expression von SDHD kann mitochondriale Dysfunktionen und eine Anreicherung von Succinat fördern und dadurch die Signalübertragung über sauerstoffsensitive und Stressantwort‑Signalwege, etwa HIF‑assoziierte Transkriptionsprogramme, verändern. SDHD ist von hoher Krankheitsrelevanz in der Tumorbiologie bei SDH‑Defizienz und in der mitochondrialen metabolischen Fehlregulation und stellt damit ein wichtiges Ziel für die Untersuchung von Genotyp‑Stoffwechsel‑Zusammenhängen dar.

SDHD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SDHD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SDHD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SDHD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SDHD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SDHD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SDHD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SDHD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SDHD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SDHD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.