Plasmide CRISPR d'Activation (m) SAV1: sc-425662-ACT

Sav1 code la protéine 1 de la famille Salvador contenant un domaine WW (SAV1), un composant d’échafaudage de la voie de signalisation Hippo qui coopère avec les kinases MST1/2 et LATS pour réguler l’activité de YAP/TAZ ainsi que les sorties transcriptionnelles contrôlant la prolifération, l’apoptose et la croissance tissulaire. Dans les cellules de souris, SAV1 soutient l’inhibition de contact et l’homéostasie épithéliale en coordonnant l’assemblage des complexes de kinases et les cascades de phosphorylation qui freinent les programmes d’expression génique pro-croissance. Une dérégulation de la signalisation Hippo liée à SAV1 est associée, dans des modèles expérimentaux, à des altérations du contrôle de la taille des organes, à des réponses régénératives aberrantes et à des phénotypes associés aux tumeurs, faisant de Sav1 un nœud utile pour étudier le contrôle de la croissance et la mécanotransduction. SAV1 est également liée à la dynamique du cytosquelette et à la signalisation des jonctions, offrant une voie pour analyser comment la polarité cellulaire et les signaux mécaniques influencent l’état transcriptionnel.

SAV1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Sav1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SAV1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Sav1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Sav1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SAV1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Sav1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SAV1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SAV1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Sav1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.