RyR-3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m2): sc-422776-ACT-2

O gene Ryr3 do camundongo codifica o receptor de rianodina 3 (RyR-3), um canal intracelular de liberação de Ca2+ localizado principalmente no retículo endoplasmático/sarcoplasmático, que medeia a liberação de cálcio induzida por cálcio e molda os transientes de cálcio citosólico. A sinalização de Ca2+ dependente de RyR-3 contribui para o acoplamento excitação–contração, a plasticidade sináptica e a regulação gênica dependente de atividade, ao modular processos como a homeostase do cálcio, o acoplamento mitocondrial e vias downstream ligadas a CaMK/CREB. Alterações na função de RyR-3 e o vazamento de cálcio mediado por receptores de rianodina têm sido implicados em fenótipos de neurodesenvolvimento e neurodegeneração, suscetibilidade a crises convulsivas e defeitos de fisiologia muscular em sistemas modelo. A edição direcionada de Ryr3 em camundongos dá suporte a estudos mecanísticos da dinâmica intracelular de cálcio, da eletrofisiologia e de respostas ao estresse do RE, permitindo validação funcional em modelos celulares neuronais e musculares e em circuitos genéticos in vivo.

RyR-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Ryr3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

RyR-3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Ryr3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Ryr3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de RyR-3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Ryr3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de RyR-3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via RyR-3 em células tumorais com expressão de Ryr3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.