RyR-3 CRISPR Activation Plasmid (m2): sc-422776-ACT-2

Das murine Gen Ryr3 kodiert den Ryanodinrezeptor 3 (RyR-3), einen intrazellulären Ca2+-Freisetzungskanal, der vorwiegend im endoplasmatischen/sarkoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist, eine durch Calcium ausgelöste Calciumfreisetzung vermittelt und zytosolische Calciumtransienten formt. Die RyR-3-abhängige Ca2+-Signalübertragung trägt zur Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung, synaptischen Plastizität und aktivitätsabhängigen Genregulation bei, indem sie Prozesse wie die Calciumhomöostase, die Kopplung an Mitochondrien und nachgeschaltete CaMK/CREB-gekoppelte Signalwege moduliert. Eine veränderte RyR-3-Funktion und ein durch Ryanodinrezeptoren vermittelter Calcium‑Leak wurden in Modellsystemen mit neuroentwicklungsbezogenen und neurodegenerativen Phänotypen, erhöhter Anfallsanfälligkeit sowie Defekten der Muskelphysiologie in Verbindung gebracht. Die gezielte Editierung von Ryr3 in der Maus unterstützt mechanistische Untersuchungen der intrazellulären Calciumdynamik, der Elektrophysiologie und von ER‑Stress‑Antworten und ermöglicht so eine funktionelle Validierung in neuronalen und muskulären Zellmodellen sowie in vivo in genetischen Schaltkreisen.

RyR-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ryr3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RyR-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ryr3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ryr3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RyR-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ryr3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RyR-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RyR-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ryr3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.