Rtl1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-436156-ACT

Das murine Rtl1 (retrotransposon-like 1) kodiert ein väterlich exprimiertes, geprägtes (imprinted) Protein, das in der sich entwickelnden Plazenta stark angereichert ist und zum fetalen Wachstum beiträgt, indem es die Trophoblastenfunktion sowie die vaskuläre Entwicklung der Plazenta unterstützt. Die Rtl1-Aktivität ist mit Prozessen verknüpft, die Zellüberleben, Differenzierung und Gewebeumbau an der maternalen–fetalen Grenzfläche steuern, mit nachgelagerten Effekten auf den Nährstoffaustausch und die Entwicklungs-Homöostase. Eine fehlregulierte RTL1-Expression wurde mit Prägungsdefekten und abnormen Plazentationsphänotypen in Verbindung gebracht, was sie für Studien zu Entwicklungsstörungen und Wachstumsregulation relevant macht. Als geprägter Lokus dient Rtl1 zudem als Modell zur Untersuchung epigenetischer Kontrolle, allelspezifischer Expression und nichtkanonischer Regulationsmechanismen in der Säugetierentwicklung.

Rtl1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Rtl1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rtl1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Rtl1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Rtl1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rtl1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Rtl1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rtl1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rtl1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Rtl1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.