RPL29 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403879-ACT

RPL29 kodiert das ribosomale Protein L29, eine basische Komponente der großen 60S‑Ribosomenuntereinheit, die zum Zusammenbau der Ribosomen und zur effizienten Translation von mRNAs im Zytoplasma beiträgt. Als Teil der zentralen Proteinsynthesemaschinerie unterstützt RPL29 die Proteostase und zelluläre Wachstumsprogramme, die eng mit der Ribosomenbiogenese und der Kontrolle der Translation gekoppelt sind. Eine veränderte Expression ribosomaler Proteine, einschließlich RPL29, wird häufig bei Zuständen mit dysregulierter Proliferation und Stressanpassung beobachtet und kann über Veränderungen der globalen und selektiven Translation zelluläre Phänotypen beeinflussen. RPL29 dient daher als nützlicher Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie Ribosomenzusammensetzung und Translationskapazität mit Zellzykluskontrolle, metabolischer Umprogrammierung und Stressantwort-Signalwegen zusammenwirken.

RPL29 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RPL29-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

RPL29 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RPL29-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RPL29-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen RPL29-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RPL29-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von RPL29-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des RPL29-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RPL29-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.