Rock-2 CRISPR Activation Plasmid (r): sc-437370-ACT

Die Rho-assoziierte, coiled-coil-haltige Proteinkinase 2 (ROCK2; Rock-2) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die nachgeschaltet von RhoA wirkt und die Aktomyosin-Kontraktilität, die Bildung von Stressfasern, die Dynamik fokaler Adhäsionen sowie das Zytoskelett-Remodeling reguliert. Durch die Phosphorylierung von Substraten wie der Myosin-Leichtkette und LIM-Kinasen verknüpft ROCK2 die Rho/ROCK-Signalübertragung mit Signalwegen, die Zellform, Motilität, Neuritenrückzug und den Tonus der glatten Muskulatur steuern. In Rattenmodellen wird eine veränderte ROCK2-Aktivität häufig im Kontext von Gefäßumbau, Fibrose, Neuroinflammation und Verletzungsreaktionen untersucht, bei denen eine abnorme zytoskelettale Spannung und Zellmigration zur Pathologie beitragen. ROCK2-abhängige Signalgebung ist zudem für die Mechanotransduktion und epithelial–mesenchymale Übergänge (EMT-ähnliche Prozesse) in unterschiedlichen Geweben relevant, was ROCK2 als zentralen Knotenpunkt für die Analyse kontraktilitätsgetriebener Phänotypen prädestiniert.

Rock-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (r) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen -Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rock-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (r) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des -Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der -Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rock-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native -Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rock-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rock-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem -Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.