Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNH1: sc-404619-ACT

RNH1 humain (inhibiteur 1 de la ribonucléase/angiogénine) code une protéine à répétitions riches en leucine qui se lie à des membres de la superfamille des RNases A et les inhibe, en particulier l’angiogénine (ANG), modulant ainsi le métabolisme de l’ARN et les programmes d’adaptation au stress. En limitant l’activité ribonucléolytique d’ANG et son rôle dans le clivage des ARNt induit par le stress, RNH1 influence le contrôle de la traduction et, plus largement, les réponses cellulaires aux signaux oxydatifs et inflammatoires. RNH1 a également été associé à l’homéostasie rédox via des effets sur la susceptibilité cellulaire aux espèces réactives de l’oxygène et la survie en conditions de stress. La dérégulation de la signalisation RNASE/ANG et des voies de l’ARN de stress est pertinente pour la neurodégénérescence, la biologie du cancer et les états inflammatoires, faisant de RNH1 un nœud utile pour des études mécanistiques des phénotypes pilotés par l’ARN.

RNH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNH1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNH1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNH1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNH1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNH1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNH1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNH1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNH1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNH1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.