Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNGTT: sc-405280-ACT

Le gène humain **RNGTT** code une guanylyltransférase et une 5′-phosphatase de l’ARN qui catalysent des étapes clés de la coiffe 5′ des ARNm, en convertissant les triphosphates 5′ des ARN naissants en coiffe m7G, en coordination avec les méthyltransférases et la machinerie de transcription. Cette structure de coiffe est indispensable à la maturation des pré-ARNm, à l’export nucléaire, à l’initiation de la traduction et à la protection contre les exonucléases, reliant l’activité de RNGTT à la transcription couplée à l’ARN polymérase II et aux programmes globaux d’expression génique. En influençant la stabilité des ARNm et l’efficacité de traduction, RNGTT s’inscrit à l’interface de voies qui régissent la progression du cycle cellulaire, les réponses au stress et la détection immunitaire innée des ARN non coiffés. Une coiffe des ARNm dérégulée et un contrôle de la traduction dépendante de la coiffe sont largement impliqués dans la biologie des maladies prolifératives et neurodéveloppementales, ce qui fait de RNGTT un nœud pertinent pour des études mécanistiques du métabolisme de l’ARN.

RNGTT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNGTT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNGTT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNGTT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNGTT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNGTT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNGTT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNGTT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNGTT dans les cellules tumorales présentant une expression de RNGTT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.