Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNF213: sc-418450-ACT

RNF213 code une grande ligase E3 d’ubiquitine à doigt RING, dotée d’une activité ATPase AAA+, qui contribue à la protéostasie dépendante de l’ubiquitine et au remodelage, en réponse au stress, des voies de signalisation cellulaires. Dans les cellules humaines, RNF213 a été impliquée dans la régulation de programmes d’immunité innée et d’inflammation, notamment des réponses associées aux interférons, ainsi que dans le contrôle de processus vasculaires et angiogéniques via la modulation du renouvellement des protéines et les interactions entre voies de signalisation. Des variations génétiques et une expression altérée de RNF213 ont été associées à des phénotypes cérébrovasculaires et vasculopathiques, dont la maladie de moyamoya, et ont été étudiées dans des contextes de fonction endothéliale et d’activation immunitaire. Ces propriétés font de RNF213 une cible pertinente pour disséquer la signalisation de l’ubiquitine, la biologie vasculaire et les mécanismes moléculaires liés à l’inflammation dans des modèles cellulaires pertinents pour les maladies.

RNF213 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNF213 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNF213 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNF213 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNF213, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNF213. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNF213 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNF213 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNF213 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNF213 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.