Plásmido CRISPR de Activación (h) RIP4: sc-404910-ACT

El RIPK4 humano codifica la quinasa 4 de serina/treonina que interactúa con el receptor (RIP4), una quinasa de señalización que actúa aguas abajo de la proteína quinasa C para regular la diferenciación de los queratinocitos, la morfogénesis epidérmica y la formación de la barrera epitelial. RIP4 participa en vías que controlan la señalización de NF-κB y MAPK, y se integra con programas del citoesqueleto y de adhesión que dan forma a la arquitectura epitelial. La actividad desregulada de RIPK4 se ha asociado con alteraciones de la homeostasis epitelial, señalización vinculada a la inflamación y biología tumoral en epitelios escamosos, lo que la hace relevante para estudios de estados de diferenciación y respuestas epiteliales al estrés. Su conectividad en distintas vías también permite el análisis mecanístico de programas transcripcionales que gobiernan el desarrollo del epitelio estratificado y la remodelación asociada a enfermedades.

RIP4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RIPK4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RIP4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RIPK4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RIPK4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RIP4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RIPK4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RIP4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RIP4 en células tumorales con expresión de RIPK4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.