Rho 8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403363-ACT

RND3 (Rho 8) ist eine atypische GTPase der Rho-Familie, die in erster Linie als Regulatorin der Aktin-Zytoskelettdynamik, der Zellform und der Zellbeweglichkeit fungiert. Sie moduliert die RhoA/ROCK-Signalgebung und die nachgeschaltete Phosphorylierung der Myosin-Leichtkette und beeinflusst dadurch die Bildung von Stressfasern, Adhäsion und Kontraktilität. RND3 ist zudem in Signalwege eingebunden, die die Zellzyklusprogression und Apoptose steuern, darunter PTEN–PI3K/AKT und p53-assoziierte Antworten. Eine dysregulierte RND3-Expression wurde in mehreren onkologischen und kardiovaskulär ausgerichteten Forschungskontexten beschrieben, in denen verändertes Zytoskelett-Remodelling und Überlebenssignalgebung zu krankheitsassoziierten Phänotypen beitragen.

Rho 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RND3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rho 8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RND3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RND3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rho 8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RND3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rho 8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rho 8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RND3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.