Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rb: sc-400116-ACT

Le gène humain **RB1** code la protéine du rétinoblastome (**Rb**), un suppresseur de tumeur central qui régule le point de contrôle **G1/S** en se liant aux facteurs de transcription **E2F** et en coordonnant l’expression des gènes du cycle cellulaire. L’activité de Rb est régulée par phosphorylation via **cycline D–CDK4/6** et **cycline E–CDK2**, reliant les signaux mitogènes à l’entrée en réplication de l’ADN, au remodelage de la chromatine et aux programmes de différenciation. Au-delà du contrôle du cycle cellulaire, **RB1** influence la stabilité du génome, la sénescence et la répression transcriptionnelle grâce à des interactions avec des modificateurs d’histones et des complexes **SWI/SNF**. La perturbation de la signalisation de la voie **RB1** est largement associée à une prolifération dérégulée et est fréquemment impliquée dans les cancers et d’autres troubles prolifératifs, faisant de **RB1** un nœud clé pour les études mécanistiques du contrôle du cycle cellulaire.

Rb Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rb Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rb. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rb au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rb dans les cellules tumorales présentant une expression de RB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.