Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rap 2A: sc-403109-ACT

RAP2A code la petite GTPase humaine Rap2A, un membre de la superfamille Ras qui alterne entre des états liés au GDP et au GTP afin de réguler la transduction du signal au niveau des membranes cellulaires. Rap2A participe à des voies contrôlant le remodelage du cytosquelette d’actine, l’adhésion médiée par les intégrines, la polarité cellulaire et le trafic vésiculaire, influençant des processus tels que la migration et la croissance des neurites. Par ses interactions avec des effecteurs en interface avec la signalisation MAPK et les réseaux de GTPases de la famille Rho, RAP2A contribue à coordonner le contrôle spatial des signaux de prolifération et de motilité. La dérégulation de la signalisation de Rap2A a été étudiée dans le contexte de la transformation oncogénique, de phénotypes invasifs, ainsi que de la biologie neurologique et vasculaire, où une adhésion et une dynamique cytosquelettique altérées sont impliquées.

Rap 2A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAP2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rap 2A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAP2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAP2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rap 2A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAP2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rap 2A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rap 2A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAP2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.