Rap 1A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400572-ACT

RAP1A kodiert Rap 1A, eine kleine GTPase der Ras-Familie, die zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen wechselt, um die Signaltransduktion an der Plasmamembran und an Endomembranen zu koordinieren. Aktives Rap 1A reguliert Integrin-„Inside-out“-Signalisierung, Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsion sowie den Umbau des Aktinzytoskeletts und beeinflusst dadurch Migration, Polarität und Barrierefunktion. Über Effektoren wie RAF-Kinasen, RIAM und RalGDS ist Rap 1A mit der MAPK-Signalisierung sowie mit Signalwegen verknüpft, die Vesikeltransport und die Dynamik zellulärer Kontaktstellen steuern. Eine fehlregulierte RAP1A-Aktivität wurde mit onkogenen Signalkontexten und verändertem invasivem Verhalten in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt in Studien zur Tumorprogression, Gefäßbiologie und zum Trafficking von Immunzellen unterstützt.

Rap 1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RAP1A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Rap 1A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RAP1A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RAP1A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Rap 1A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RAP1A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Rap 1A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Rap 1A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RAP1A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.