RAMP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401396-ACT

La receptor activity–modifying protein 1 (RAMP1) è una subunità accessoria di membrana a singolo passaggio che controlla il traffico intracellulare, la specificità per il ligando e l’output di segnalazione dei complessi di GPCR di classe B, in particolare associandosi al recettore simile al recettore della calcitonina (CALCRL) per formare il recettore canonico del CGRP. Modellando la maturazione del recettore e la sua localizzazione sulla superficie cellulare, RAMP1 influenza la segnalazione cAMP/PKA guidata dal CGRP e i programmi trascrizionali a valle che regolano il tono neurovascolare e le risposte infiammatorie ai neuropeptidi. La segnalazione dipendente da RAMP1 è stata ampiamente implicata nei meccanismi alla base della biologia dell’emicrania e, più in generale, in processi neurovascolari e legati al dolore; inoltre è studiata nella regolazione cardiovascolare e nella fisiologia delle vie aeree. Di conseguenza, la modulazione dell’espressione di RAMP1 è utile per analizzare la funzione delle proteine accessorie dei GPCR, la farmacologia recettoriale e il bias di segnalazione dipendente dal contesto in modelli cellulari umani pertinenti.

RAMP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RAMP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

RAMP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RAMP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RAMP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di RAMP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RAMP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da RAMP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via RAMP1 nelle cellule tumorali con espressione di RAMP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.