Plasmide CRISPR d'Activation (h) Rab 4A: sc-401828-ACT

RAB4A code la petite GTPase Rab4A, un régulateur clé de la dynamique des endosomes précoces et du recyclage rapide des cargos internalisés vers la membrane plasmique. Rab4A coordonne le bourgeonnement, la motilité et l’arrimage des vésicules via des interactions avec des effecteurs endosomaux, influençant le trafic de récepteurs et de transporteurs qui modulent la transduction du signal et la composition membranaire. En contrôlant le recyclage endocytaire, RAB4A affecte des processus tels que le renouvellement des récepteurs aux facteurs de croissance, l’absorption des nutriments et le remodelage du cytosquelette. Un trafic dépendant de Rab4A dérégulé a été étudié dans le contexte de la signalisation oncogénique, de la régulation métabolique et de phénotypes neurodégénératifs, où une fonction endosomale altérée perturbe l’homéostasie cellulaire.

Rab 4A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAB4A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Rab 4A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAB4A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAB4A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Rab 4A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAB4A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Rab 4A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Rab 4A dans les cellules tumorales présentant une expression de RAB4A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.