R-Ras CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402126-ACT

RRAS kodiert die kleine GTPase R-Ras, einen Signal-Knoten der Ras-Familie, der zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen zyklisch wechselt und dadurch integrinabhängige Adhäsion, Zytoskelettdynamik und Membrantransport reguliert. In menschlichen Zellen trägt R-Ras zur Steuerung von Zellmigration und Überlebenssignalen über Signalwege bei, die mit den PI3K/AKT- und MAPK-Kaskaden verzahnt sind, und beeinflusst so das Verhalten von Endothel- und glatten Muskelzellen. Veränderte RRAS-Aktivität wurde mit einer dysregulierten Gefäßremodellierung und aberranten Programmen der Zellmotilität in Verbindung gebracht, wie sie bei Krebs und Entwicklungsstörungen beobachtet werden. Diese Eigenschaften machen RRAS zu einem nützlichen Ziel, um adhäsionsvermittelte Signalgebung, Invasionsphänotypen und kontextabhängige Verschaltungen innerhalb des Ras-Netzwerks zu untersuchen.

R-Ras Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RRAS-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

R-Ras Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RRAS-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RRAS-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen R-Ras-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RRAS-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von R-Ras-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des R-Ras-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RRAS-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.