Plasmide CRISPR d'Activation (h) PTG: sc-404419-ACT

PPP1R3C code la protéine « protein targeting to glycogen » (PTG), une sous-unité régulatrice qui recrute la protéine phosphatase 1 vers les particules de glycogène et coordonne la déphosphorylation d’enzymes clés contrôlant la synthèse et la dégradation du glycogène. En servant d’échafaudage à l’activité phosphatase à proximité des complexes du métabolisme du glycogène, PTG contribue à ajuster le stockage cellulaire du glucose, l’homéostasie énergétique et les interactions de signalisation avec des voies sensibles aux nutriments. Une expression altérée de PPP1R3C ou une dysfonction de PTG a été associée à une accumulation de glycogène dérégulée et à des phénotypes métaboliques pertinents pour les tissus sensibles à l’insuline. Par conséquent, PPP1R3C est largement étudié dans des modèles de gestion du glucose, d’adaptation au stress et de régulation métabolique spécifique aux tissus.

PTG Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP1R3C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PTG Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP1R3C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP1R3C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PTG. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP1R3C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PTG au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PTG dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP1R3C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.