PTBP-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404312-ACT

Das humane Gen **PTBP2** kodiert das RNA-bindende Protein **PTBP-2**, einen in Neuronen angereicherten Regulator des alternativen pre-mRNA-Spleißens, der während der Neurogenese und der synaptischen Reifung die Exon-Inklusion, die mRNA-Stabilität und die Translation beeinflusst. PTBP-2 koordiniert die Auswahl von Spleißstellen über Transkripte hinweg, die an neuronaler Differenzierung, Zytoskelett-Umbau und aktivitätsabhängiger Genexpression beteiligt sind, und greift dabei in posttranskriptionelle Regulationsnetzwerke ein, die die Zellidentität prägen. Eine veränderte PTBP2-Expression oder veränderte Spleißprogramme wurden mit einer Fehlregulation der neuronalen Entwicklung sowie mit aberranten RNA-Prozessierungsmustern in Kontexten neuroentwicklungsbezogener und neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Als Modulator des Gleichgewichts von Transkript-Isoformen wird PTBP-2 breit untersucht, um Spleißentscheidungen mit der Festlegung der neuronalen Linie und der neuronalen Funktion zu verknüpfen.

PTBP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTBP2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PTBP-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTBP2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTBP2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PTBP-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTBP2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PTBP-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PTBP-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTBP2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.