Plasmide CRISPR d'Activation (h) Prestin: sc-401428-ACT

SLC26A5 code la prestine, une protéine motrice membranaire de type transporteur d’anions, fortement enrichie dans les cellules ciliées externes de la cochlée, qui convertit les variations du potentiel membranaire en une électromotilité rapide. Cette transduction électromécanique soutient l’amplification cochléaire et une sélectivité fréquentielle fine, en intégrant l’homéostasie ionique à un cycle de changements conformationnels dépendant du voltage au niveau de la membrane plasmique. L’activité de la prestine est liée aux processus de transport ionique épithélial ainsi qu’aux propriétés spécialisées du cytosquelette et de la mécanique membranaire nécessaires à la fonction auditive. Une expression ou une fonction altérée de SLC26A5 est associée à des phénotypes de surdité neurosensorielle et sert de point d’entrée moléculaire pour étudier la biomécanique des cellules ciliées et les dérégulations des voies auditives.

Prestin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC26A5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Prestin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC26A5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC26A5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Prestin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC26A5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Prestin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Prestin dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC26A5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.