PPX CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403212-ACT

PPP4C kodiert die katalytische Untereinheit der Proteinphosphatase 4 (auch als PPX bekannt), einer Serin/Threonin-Phosphatase, die phosphorylierungsabhängige Signalnetzwerke reguliert, welche den Zellzyklusfortschritt, die Organisation des Zentrosoms, die Mikrotubuli-Dynamik und die DNA-Schadensantwort steuern. Durch die Assoziation mit regulatorischen Untereinheiten moduliert PPX die Substratspezifität in Signalwegen, die mit Chromatin-Remodeling und Checkpoint-Kontrolle verknüpft sind, und beeinflusst dadurch die Genomstabilität und die Toleranz gegenüber Replikationsstress. Eine veränderte PP4/PPP4C-Aktivität wurde mit dysregulierter Proliferation und beeinträchtigter Reparatursignalgebung in Verbindung gebracht, was sie für Studien zur Tumorbiologie und zu anderen Erkrankungen relevant macht, die durch defekte Zellzyklus- und Stressantwortwege gekennzeichnet sind.

PPX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPP4C-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PPX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPP4C-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPP4C-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PPX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPP4C-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PPX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PPX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPP4C-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.