PPOX CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410546-ACT

Das humane PPOX (Protoporphyrinogen-Oxidase) ist ein Enzym der inneren Mitochondrienmembran, das die Oxidation von Protoporphyrinogen IX zu Protoporphyrin IX katalysiert – ein entscheidender später Schritt der Hämbiosynthese. Durch die Steuerung des Porphyrinflusses unterstützt PPOX die Bildung von Hämproteinen und das zelluläre Redoxgleichgewicht und verknüpft damit den mitochondrialen Stoffwechsel mit der Sauerstoffverwertung und Antworten auf oxidativen Stress. Eine Störung oder Fehlregulation der PPOX-Aktivität verändert die Porphyrinhomöostase und ist mit Porphyrie-Phänotypen assoziiert, die durch eine abnorme Anreicherung von Porphyrinen gekennzeichnet sind. PPOX wird daher umfassend in Signal- und Stoffwechselwegen untersucht, die den Häm-/Porphyrinmetabolismus, die Mitochondrienfunktion und die Signalgebung bei metabolischem Stress steuern.

PPOX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PPOX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PPOX Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PPOX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PPOX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PPOX-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PPOX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PPOX-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PPOX-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PPOX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.