Plasmide CRISPR d'Activation (h) PP2B-Aβ: sc-402853-ACT

PPP3CB code la sous-unité catalytique bêta de la calcineurine (PP2B-Aβ), une phosphatase sérine/thréonine dépendante du Ca2+/calmoduline qui couple les signaux calciques intracellulaires à des réponses transcriptionnelles et post-traductionnelles. La calcineurine déphosphoryle les facteurs de transcription de la famille NFAT afin de réguler des programmes géniques impliqués dans la signalisation immunitaire, la plasticité synaptique et l’adaptation au stress cellulaire ; elle interagit également avec les voies MAPK, Wnt et celles du remodelage du cytosquelette. Une activité dérégulée de PPP3CB a été associée à des modifications de l’excitabilité neuronale et à des phénotypes neurodéveloppementaux, et une signalisation aberrante de la calcineurine est étudiée dans l’inflammation, l’hypertrophie des cardiomyocytes et les transitions d’état des cellules cancéreuses. En tant que nœud central de la signalisation dépendante du calcium, PP2B-Aβ constitue un levier exploitable pour disséquer les circuits transcriptionnels dépendants des signaux et les réseaux régulés par des phosphatases.

PP2B-Aβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PPP3CB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PP2B-Aβ Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PPP3CB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PPP3CB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PP2B-Aβ. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PPP3CB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PP2B-Aβ au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PP2B-Aβ dans les cellules tumorales présentant une expression de PPP3CB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.