POU3F4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422353-ACT

Pou3f4 kodiert POU3F4, einen POU-Homeobox-Transkriptionsfaktor, der während der embryonalen Entwicklung Genexpressionsprogramme steuert und eine wichtige Rolle bei der Musterbildung des otischen Mesenchyms sowie in der Neuroentwicklung spielt. Durch Bindung an oktamerähnliche DNA-Motive reguliert POU3F4 linienspezifische transkriptionelle Netzwerke, die Zellschicksalsentscheidungen, Gewebemorphogenese und den Zeitpunkt der Differenzierung beeinflussen. In Mausmodellen stört eine veränderte Pou3f4-Aktivität die Entwicklung des Innenohrs und die neuronale Konnektivität, was Pou3f4 für Studien zur Entstehung sensorischer Systeme und zur transkriptionellen Kontrolle in der Entwicklung relevant macht. Eine Funktionsstörung des menschlichen Orthologs ist mit X‑chromosomalem Hörverlust assoziiert und stützt translational ausgerichtete Untersuchungen zu konservierten Mechanismen der auditiven Pathophysiologie.

POU3F4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pou3f4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

POU3F4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pou3f4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pou3f4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen POU3F4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pou3f4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von POU3F4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des POU3F4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pou3f4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.