Plásmido CRISPR de Activación (h) Positive cofactor 4: sc-403272-ACT

El gen humano SUB1 codifica el cofactor positivo 4 (PC4), un coactivador transcripcional de unión al ADN que modula la transcripción mediada por la ARN polimerasa II al estabilizar complejos de preiniciación y coordinar la expresión génica dependiente de activadores. PC4 también participa en el mantenimiento del genoma al influir en las respuestas al daño del ADN y en la dinámica de la cromatina asociada a la reparación, vinculando el control transcripcional con el estrés replicativo y los programas celulares de recuperación. A través de estas funciones, SUB1/PC4 se ha estudiado en vías que regulan la progresión del ciclo celular, la transcripción sensible al estrés y el equilibrio entre transcripción y reparación del ADN. Se han descrito actividad desregulada de PC4 y patrones alterados de expresión de SUB1 en múltiples contextos relevantes para enfermedades, lo que respalda su utilidad como un nodo mecanístico para analizar la estabilidad genómica acoplada a la transcripción.

Positive cofactor 4 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SUB1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Positive cofactor 4 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SUB1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SUB1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Positive cofactor 4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SUB1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Positive cofactor 4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Positive cofactor 4 en células tumorales con expresión de SUB1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.