POLR1E CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407602-ACT

POLR1E kodiert eine zentrale Untereinheit der RNA-Polymerase I, eines Multiproteinkomplexes, der für die Transkription ribosomaler RNA‑Vorläufer verantwortlich ist, welche die Ribosomenbiogenese im Nukleolus einleiten. Durch die Unterstützung der prä‑rRNA‑Synthese und ‑Prozessierung trägt POLR1E zur Kontrolle des Zellwachstums, zur Kapazität der Proteostase sowie zu nukleolären Stress-Signalwegen bei, die die Ribosomenproduktion mit der Zellzyklusregulation verknüpfen. Störungen der Funktion der RNA‑Polymerase I können die Homöostase der Proteinsynthese beeinträchtigen und Stressantworten wie p53‑assoziierte Checkpoints aktivieren, wodurch POLR1E für Studien zu Proliferation, Differenzierung und Genomstabilität relevant ist. Genetische Befunde verbinden eine POLR1E‑Dysfunktion mit ribosomopathieähnlichen Phänotypen beim Menschen und Entwicklungsstörungen und unterstreichen damit seine Bedeutung in Geweben mit hohem biosynthetischem Bedarf.

POLR1E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLR1E-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

POLR1E Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLR1E-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLR1E-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen POLR1E-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLR1E-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von POLR1E-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des POLR1E-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLR1E-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.