Plasmide CRISPR d'Activation (h) PMCA2: sc-403416-ACT

ATP2B2 code pour l’ATPase Ca2+ de la membrane plasmique, isoforme PMCA2, une pompe d’extrusion du Ca2+ à haute affinité qui maintient un faible calcium cytosolique et module les transitoires de Ca2+ dépendants des stimuli. En couplant l’hydrolyse de l’ATP à l’efflux de Ca2+, PMCA2 soutient des réseaux de signalisation dépendants du calcium qui régulent l’excitabilité neuronale, la transmission synaptique et les processus de transport épithélial. L’activité de PMCA2 s’inscrit à l’interface de voies régulées par la calmoduline, de la signalisation au sein des microdomaines membranaires et de boucles de rétrocontrôle homéostatiques qui préviennent le stress protéotoxique et mitochondrial induit par le Ca2+. Une expression ou une fonction altérée d’ATP2B2/PMCA2 a été associée à une dérégulation de l’homéostasie du calcium impliquée dans des phénotypes neurologiques et des dysfonctionnements des systèmes sensoriels, ce qui souligne sa pertinence pour des études mécanistiques de la signalisation du Ca2+.

PMCA2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP2B2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PMCA2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP2B2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP2B2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PMCA2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP2B2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PMCA2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PMCA2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP2B2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.