Plásmido CRISPR de Activación (h) PMCA1: sc-402691-ACT

ATP2B1 codifica la Ca2+-ATPasa 1 de la membrana plasmática humana (PMCA1), una bomba de eflujo de Ca2+ de alta afinidad que restablece niveles bajos de calcio citosólico tras eventos de señalización. Al exportar Ca2+ al espacio extracelular, PMCA1 modula la amplitud y la duración de las vías dependientes de Ca2+ que regulan la excitabilidad de la membrana, la secreción, la dinámica del citoesqueleto y los programas de transcripción. La actividad de PMCA1 se integra con la regulación dependiente de calmodulina y con efectores aguas abajo como CaMK y calcineurina/NFAT para mantener la homeostasis del Ca2+ celular. La desregulación del manejo del calcio en la que participa ATP2B1 se ha vinculado, en estudios genéticos y funcionales, con fenotipos cardiovasculares y neurobiológicos, lo que respalda su relevancia en la investigación mecanística de procesos patológicos impulsados por el calcio.

PMCA1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ATP2B1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PMCA1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ATP2B1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ATP2B1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PMCA1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ATP2B1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PMCA1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PMCA1 en células tumorales con expresión de ATP2B1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.