PLP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401663-ACT

PLP1 codifica a proteína proteolipídica 1 (PLP), um importante componente estrutural da mielina compacta no sistema nervoso central, que sustenta a arquitetura da membrana dos oligodendrócitos e a condução axonal eficiente. A PLP participa da montagem e da manutenção da bainha de mielina por meio da organização de membranas ricas em lipídios e de vias de biogênese da mielina que regulam a integridade da substância branca. Alterações na dosagem ou na sequência de PLP1 prejudicam a mielinização e a função dos oligodendrócitos e estão associadas a leucodistrofias hipomielinizantes hereditárias e a fenótipos neurodesenvolvimentais e neurodegenerativos relacionados. Por isso, PLP1 é frequentemente estudado em modelos de diferenciação de oligodendrócitos, interações axônio–glia e mecanismos de estabilidade da mielina.

PLP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PLP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PLP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PLP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PLP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PLP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PLP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PLP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PLP em células tumorais com expressão de PLP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.