PKC mu CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401070-ACT

PRKD1 kodiert die Proteinkinase D1 (PKC mu), eine Serin/Threonin-Kinase, die nachgeschaltet von Diacylglycerol- und neuartiger PKC-Signalgebung aktiviert wird und die phosphorylierungsabhängige Kontrolle von Membrantransport, zytoskelettalem Umbau und Transkriptionsprogrammen koordiniert. PKC mu ist an Signalwegen beteiligt, die Eingänge von GPCRs und Rezeptor-Tyrosinkinasen mit der MAPK-Signalgebung, NF-κB-assoziierten Antworten sowie der Regulation von Zellüberleben und Zellmotilität verknüpfen. In menschlichen Zellen wurde die PRKD1-Aktivität mit der Modulation der Epithelpolarität, dem sekretorischen Transport aus dem trans-Golgi-Netzwerk und stressresponsiven Signalnetzwerken in Verbindung gebracht. Eine fehlregulierte PRKD1-Signalgebung wurde in mehreren krankheitsrelevanten Kontexten beschrieben, darunter veränderte Proliferations- und Migrationsphänotypen sowie inflammatorische Signalgebung, was ihre Nutzung als mechanistischen Knotenpunkt für die Analyse von Signalwegen unterstützt.

PKC mu Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKD1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKC mu Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKD1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKD1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKC mu-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKD1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKC mu-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKC mu-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKD1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.