Plasmide CRISPR d'Activation (h) PKC mu: sc-401070-ACT

PRKD1 code la protéine kinase D1 (PKC mu), une kinase sérine/thréonine activée en aval du diacylglycérol et de la signalisation des PKC « nouvelles », qui coordonne un contrôle dépendant de la phosphorylation du trafic membranaire, du remodelage du cytosquelette et de programmes transcriptionnels. PKC mu participe à des voies reliant des signaux issus des GPCR et des récepteurs à activité tyrosine kinase à la signalisation MAPK, à des réponses associées à NF-κB, ainsi qu’à la régulation de la survie et de la motilité cellulaires. Dans les cellules humaines, l’activité de PRKD1 a été associée à la modulation de la polarité épithéliale, au transport sécrétoire depuis le réseau trans-Golgi et à des réseaux de signalisation sensibles au stress. Une dérégulation de la signalisation PRKD1 a été rapportée dans de multiples contextes pertinents pour les maladies, notamment des phénotypes prolifératifs et migratoires altérés et une signalisation inflammatoire, ce qui en fait un nœud mécanistique utile pour l’interrogation des voies de signalisation.

PKC mu Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PRKD1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PKC mu Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PRKD1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PRKD1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PKC mu. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PRKD1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PKC mu au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PKC mu dans les cellules tumorales présentant une expression de PRKD1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.