PKC lambda/iota CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402111-ACT

PRKCI kodiert die atypische Protein-Kinase-C-Isoform PKC lambda/iota, eine Serin/Threonin-Kinase, die in Polaritäts- und Signalgebungskomplexen wirkt, um die epitheliale Organisation, asymmetrische Zellteilung und die Dynamik des Zytoskeletts zu regulieren. Als nachgeschalteter Effektor von Phosphoinositid- und kleinen GTPase-Signalen ist PRKCI an der Par3–Par6-Polaritätssignalgebung beteiligt und steht mit Signalwegen in Verbindung, die Zellüberleben, Migration und die Integrität von Zell-Zell-Kontakten steuern. Eine fehlregulierte PRKCI-Aktivität oder -Expression wurde in verschiedenen Krankheitskontexten mit veränderten Polaritätsprogrammen und proliferativer Signalgebung in Zusammenhang gebracht, darunter krebsassoziierte Phänotypen wie Invasion und Resistenz gegenüber apoptotischen Signalen. Diese Eigenschaften machen PRKCI zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zur polaritätsabhängigen Signalgebung, zu Stressantworten und zu Zellzustandsübergängen.

PKC lambda/iota Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PRKCI-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PKC lambda/iota Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PRKCI-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PRKCI-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PKC lambda/iota-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PRKCI-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PKC lambda/iota-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PKC lambda/iota-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PRKCI-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.