PINK1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-427236-ACT

Pink1 kodiert die PTEN-induzierte vermutete Kinase 1 (PINK1), eine mitochondriale Serin/Threonin-Kinase, die als Sensor für eine Depolarisation der Mitochondrien dient und ein zentraler Initiator der Mitophagie ist. Beim Verlust des mitochondrialen Membranpotenzials akkumuliert PINK1 an der äußeren Mitochondrienmembran und fördert Phosphorylierungsereignisse, die die Rekrutierung und Aktivierung von PARK2/Parkin erleichtern, was zur ubiquitinabhängigen Beseitigung geschädigter Mitochondrien führt. Dieser Signalweg verknüpft die mitochondriale Qualitätskontrolle mit zellulären Stressantworten, der Bioenergetik und der angeborenen Signalgebung. Eine Fehlregulation der PINK1-abhängigen Mitophagie und der mitochondrialen Homöostase ist eng mit Neurodegeneration und für die Parkinson-Krankheit relevanten Mechanismen verbunden, darunter oxidativer Stress und eine beeinträchtigte Proteostase.

PINK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pink1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PINK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pink1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pink1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PINK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pink1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PINK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PINK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pink1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.