PINK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-427236-ACT

Pink1 codifica a PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1), uma quinase mitocondrial de Ser/Thr que atua como sensor da despolarização mitocondrial e como um iniciador-chave da mitofagia. Com a perda do potencial de membrana mitocondrial, a PINK1 acumula-se na membrana externa da mitocôndria e promove eventos de fosforilação que facilitam o recrutamento e a ativação de PARK2/parkin, levando à eliminação, dependente de ubiquitina, de mitocôndrias danificadas. Esta via integra o controlo de qualidade mitocondrial com respostas celulares ao stress, a bioenergética e a sinalização inata. A desregulação da mitofagia dependente de PINK1 e da homeostase mitocondrial está fortemente associada à neurodegeneração e a mecanismos relevantes para a doença de Parkinson, incluindo stress oxidativo e proteostase comprometida.

PINK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Pink1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PINK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Pink1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Pink1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PINK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Pink1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PINK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PINK1 em células tumorais com expressão de Pink1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.