Plásmido CRISPR de Activación (m) PHLPPL: sc-434083-ACT

Phlpp2 en ratón codifica PHLPPL, una fosfatasa de Ser/Thr de la familia PP2C que atenúa la señalización inducida por factores de crecimiento al desfosforilar quinasas AGC, en particular AKT en Ser473, limitando así la amplitud de la vía PI3K–AKT y los programas metabólicos y de supervivencia aguas abajo vinculados a mTOR. Mediante la regulación negativa de la fosforilación de quinasas, PHLPPL contribuye a modular decisiones celulares relacionadas con la proliferación, la apoptosis y las respuestas al estrés, y puede influir en el control por retroalimentación dentro de las redes de señalización de receptores tirosina cinasa. En la literatura, la actividad alterada de PHLPP/PHLPPL se ha asociado con una homeostasis de señalización desregulada relevante para la transformación oncogénica, el metabolismo de la insulina/energético y fenotipos relacionados con la inflamación, lo que hace de Phlpp2 un nodo útil para estudios mecanísticos del amortiguamiento de vías. Como fosfatasa que contrarresta cascadas impulsadas por quinasas, PHLPPL también es relevante para analizar los efectos de la duración de la señal y los mecanismos de resistencia adaptativa en modelos celulares.

PHLPPL El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Phlpp2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

PHLPPL El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Phlpp2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Phlpp2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de PHLPPL. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Phlpp2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de PHLPPL en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía PHLPPL en células tumorales con expresión de Phlpp2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.