Pez CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402896-ACT

PTPN14 kodiert die Protein-Tyrosinphosphatase Non-Receptor Type 14 (Pez), eine zytoplasmatische Phosphatase, die Signale integriert, welche Zelladhäsion, Polarität und kontaktabhängiges Wachstum steuern. Pez ist an Signalwegen beteiligt, die auf die transkriptionelle Regulation über Hippo–YAP/TAZ zusammenlaufen, und koordiniert den Umbau des Aktinzytoskeletts durch Interaktionen an Zell-Zell-Kontakten und in fokalen Adhäsionskomplexen. Durch die Modulation phosphorylierungsabhängiger Signalnetzwerke beeinflusst PTPN14 die epitheliale Organisation, Migration und Mechanotransduktion. Eine veränderte PTPN14-Aktivität oder -Expression wurde in mehreren krebsrelevanten Kontexten mit fehlregulierter Proliferation und invasiven Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch PTPN14 für Studien zur Tumorsuppressor-Signalgebung und zur Homöostase von Zellkontakten relevant ist.

Pez Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PTPN14-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Pez Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PTPN14-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PTPN14-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Pez-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PTPN14-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Pez-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Pez-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PTPN14-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.