Plasmide CRISPR d'Activation (h) Pericentrin 1: sc-403161-ACT

NUP85 code un composant central du sous-complexe Nup107–160 du complexe du pore nucléaire, contribuant au transport nucléocytoplasmique et au maintien de l’architecture de l’enveloppe nucléaire tout au long du cycle cellulaire. Par ses rôles dans l’assemblage du CPN, la progression mitotique et la stabilité du génome, NUP85 influence les programmes transcriptionnels en régulant l’import/export nucléaires de médiateurs de signalisation et de facteurs du cycle cellulaire. La perturbation des composants du pore nucléaire a été associée à des défauts de maturation des ARN, des réponses au stress et une prolifération aberrante dans plusieurs contextes pathologiques, faisant de NUP85 un point d’entrée utile pour étudier la régulation de la physiologie cellulaire couplée au transport. Dans des modèles cellulaires humains, on peut examiner les conséquences d’une activité de NUP85 altérée sur le trafic nucléaire, le contrôle des points de contrôle et le remodelage des voies en aval.

Pericentrin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NUP85 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Pericentrin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NUP85 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NUP85, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Pericentrin 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NUP85 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Pericentrin 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Pericentrin 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de NUP85 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.