PEPT1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401259-ACT

SLC15A1 codifica o transportador de oligopéptidos acoplado a protões PEPT1, um importante sistema de captação na membrana apical das células epiteliais intestinais, que importa di- e tripeptídeos e numerosos substratos peptidomiméticos. O PEPT1 acopla o transporte de substratos ao gradiente transmembranar de H+, ligando a absorção de nutrientes à homeostase do pH celular e à integração metabólica da disponibilidade de aminoácidos. Devido ao seu papel na fisiologia da barreira epitelial e em processos de deteção de nutrientes, alterações na expressão de PEPT1 têm sido estudadas na inflamação gastrointestinal e em fenótipos de transporte intestinal desregulados. In vitro, o PEPT1 é frequentemente utilizado para modelar mecanismos de captação epitelial, a regulação de transportadores por sinais inflamatórios e a competição entre substratos em sistemas relevantes para o intestino.

PEPT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC15A1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PEPT1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC15A1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC15A1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PEPT1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC15A1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PEPT1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PEPT1 em células tumorais com expressão de SLC15A1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.