PEPCK-M/PCK2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400725-ACT

O PCK2 humano codifica a isoforma mitocondrial da fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK-M), uma enzima-chave da gliconeogênese que converte oxaloacetato em fosfoenolpiruvato utilizando GTP. Ao acoplar a anaplerose/cataplerose mitocondrial à biossíntese citosólica de carboidratos e lipídios, a PEPCK-M ajuda a coordenar o fluxo do ciclo do TCA (ciclo do ácido tricarboxílico), o equilíbrio redox e a flexibilidade metabólica dependente de nutrientes. A atividade de PCK2 está ligada ao metabolismo central do carbono e pode influenciar vias como gliconeogênese, gliceroneogênese e a utilização de carbono derivado de aminoácidos. A expressão alterada de PCK2 tem sido associada à reprogramação metabólica observada em distúrbios da homeostase da glicose e no metabolismo tumoral, tornando-o um alvo útil para estudar o controle mitocondrial de programas biossintéticos.

PEPCK-M/PCK2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PCK2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

PEPCK-M/PCK2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PCK2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PCK2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de PEPCK-M/PCK2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PCK2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de PEPCK-M/PCK2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via PEPCK-M/PCK2 em células tumorais com expressão de PCK2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.