PEDF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400849-ACT

SERPINF1 kodiert den vom Pigmentepithel abgeleiteten Faktor (PEDF), ein sezerniertes Glykoprotein aus der Serpin-Familie, das als starker Regulator von Angiogenese, Entzündung und Gewebehomöostase wirkt. PEDF moduliert das Überleben und die Migration von Endothelzellen und beeinflusst den Umbau der extrazellulären Matrix sowie Reaktionen auf oxidativen Stress; dadurch trägt es in mehreren Geweben zum vaskulären und neurotrophen Gleichgewicht bei. Eine veränderte SERPINF1-/PEDF-Expression wurde mit fehlreguliertem vaskulärem Remodeling und fibrotischen Programmen in Verbindung gebracht; Studien zeigen Zusammenhänge mit okulären Neovaskularisations-Erkrankungen und allgemeineren Veränderungen des stromalen Mikromilieus. Zudem werden Loss-of-Function-Varianten von SERPINF1 mit Phänotypen erhöhter Skelettfragilität assoziiert, was die Rolle von PEDF in der Biologie von Bindegewebe und Mineralisierung unterstreicht.

PEDF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SERPINF1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PEDF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SERPINF1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SERPINF1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PEDF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SERPINF1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PEDF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PEDF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SERPINF1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.