PDLIM5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405340-ACT

PDLIM5 kodiert ein Gerüstprotein mit PDZ- und LIM-Domänen, das an aktinassoziierten Strukturen lokalisiert und die Organisation des Zytoskeletts mit der Signaltransduktion verknüpft. In menschlichen Zellen ist PDLIM5 an der Regulation der Aktindynamik, der Zelladhäsion und mechanosensitiver Signalwege beteiligt, indem es Protein-Protein-Interaktionen an Stressfasern und Z-Scheiben-ähnlichen Assemblierungen koordiniert. Über diese Funktionen beeinflusst es Prozesse wie Zellmorphologie, Migration und Kontraktilität und ist in Kinase-Signalnetzwerke eingebunden, die auf zytoskelettäre Signale reagieren. Veränderte PDLIM5-Expression und Signalwegaktivität wurden im Zusammenhang mit kardiovaskulärer sowie neuropsychiatrischer Krankheitsbiologie untersucht, was seine Eignung als Knotenpunkt zur Erforschung zytoskelettgekoppelter Signalmechanismen unterstreicht.

PDLIM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDLIM5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDLIM5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDLIM5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDLIM5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDLIM5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDLIM5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDLIM5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDLIM5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDLIM5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.