PDE10A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403981-ACT

Humanes PDE10A kodiert die Phosphodiesterase 10A, eine Dual-Substrat-Phosphodiesterase, die cAMP und cGMP hydrolysiert und so die Dynamik der zyklischen Nukleotid-Signalübertragung fein abstimmt. Durch die Modulation des Second-Messenger-Grundtons reguliert PDE10A die Signalweg-Ausgabe der PKA- und PKG-Kaskaden und beeinflusst damit phosphorylierungsabhängige Transkriptionsprogramme, die Aktivität von Ionenkanälen und die synaptische Signalübertragung. PDE10A ist stark in neuronale Signalnetzwerke eingebunden, in denen eine veränderte Homöostase zyklischer Nukleotide mit der Biologie neuropsychiatrischer und neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung steht. Seine Position im Signalweg macht es zudem zu einem nützlichen Knotenpunkt, um das Cross-Talk zwischen GPCR-Signalisierung, intrazellulären Kinasekaskaden und kontextabhängiger Genexpression zu untersuchen.

PDE10A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PDE10A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PDE10A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PDE10A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PDE10A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PDE10A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PDE10A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PDE10A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PDE10A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PDE10A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.