PCMT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-418153-ACT

Protein-L-Isoaspartat-(D-Aspartat)-O-Methyltransferase 1 (PCMT1) ist eine konservierte Methyltransferase zur Proteinreparatur, die Isoaspartylreste erkennt, die durch spontane Deamidierung oder Isomerisierung entstehen, und eine Methylierung katalysiert, um die Proteinfaltung und den Proteinumsatz zu erleichtern. Indem PCMT1 die Anreicherung geschädigter Proteine begrenzt, unterstützt es Proteostase-Netzwerke, die sich mit zellulären Stressantworten, der altersassoziierten Qualitätskontrolle von Proteinen und der Regulation der Proteinstabilität überschneiden. Die PCMT1-Aktivität wurde mit neuronaler und metabolischer Homöostase in Verbindung gebracht, wobei eine beeinträchtigte Reparaturkapazität zur Anhäufung dysfunktionaler Proteine und zu erhöhter zellulärer Verwundbarkeit unter Stress beitragen kann. Eine Fehlregulation von Proteinreparaturwegen unter Beteiligung von PCMT1 ist daher relevant für Studien zu Neurodegeneration, zur Biologie des oxidativen Stresses und zu allgemeinen Mechanismen von Proteinschäden in menschlichen Zellen.

PCMT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCMT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PCMT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCMT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCMT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PCMT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCMT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PCMT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PCMT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCMT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.