PCM1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401360-ACT

Humanes PCM1 kodiert Pericentriolar Material 1, ein mit Zentrosomen und zentriolaren Satelliten assoziiertes Gerüstprotein, das die perizentrioläre Matrix organisiert und die Integrität des Zentrosoms unterstützt. PCM1 hilft dabei, zentrosomale Komponenten wie Faktoren des γ‑Tubulin-Ringkomplexes und Satellitenproteine zu rekrutieren und zu verankern, und verknüpft so die Mikrotubuli-Nukleation, die Zentrosomenreifung und den Zellzyklusfortschritt. Über diese Funktionen beeinflusst es die Ziliogenese und die Organisation des Zytoskeletts – Prozesse, die zentral für mitotische Genauigkeit und intrazellulären Transport sind. Eine Fehlregulation von PCM1 sowie Umlagerungen unter Beteiligung von PCM1 wurden in onkologischen und neuroentwicklungsbezogenen Zusammenhängen beschrieben, was PCM1 zu einem relevanten Knotenpunkt für die Untersuchung zentrosomenassoziierter Genomstabilität und Signalphänotypen macht.

PCM1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen PCM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

PCM1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des PCM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der PCM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen PCM1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native PCM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von PCM1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des PCM1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem PCM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.