Parkin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424514-ACT

Mouse Park2 codiert für Parkin, eine E3-Ubiquitin-Ligase, die den ubiquitinabhängigen Proteinabbau und die Qualitätskontrolle der Mitochondrien koordiniert. Parkin wird nachgeschaltete von PINK1 an geschädigte Mitochondrien rekrutiert und treibt die Mitophagie an, indem es Substrate der äußeren Mitochondrienmembran ubiquitiniert und die Einbindung von Autophagosomen moduliert; darüber hinaus übernimmt es zusätzliche Funktionen in der Proteostase und bei Stressantworten. Diese Aktivitäten überschneiden sich mit Signalwegen, die oxidativen Stress, Bioenergetik und angeborene Immun-Signalgebung im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion steuern. Eine Fehlregulation der Park2/Parkin-Funktion wird intensiv im Kontext von Neurodegeneration und der zellulären Anfälligkeit für mitochondriale Schäden untersucht und macht Park2 zu einem wichtigen Ziel für mechanistische Studien der mitochondrialen Homöostase.

Parkin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Park2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Parkin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Park2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Park2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Parkin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Park2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Parkin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Parkin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Park2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.