Parafibromin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401334-ACT

CDC73 kodiert Parafibromin, einen nukleären Tumorsuppressor, der als zentraler Bestandteil des transkriptionellen Regulationskomplexes PAF1 fungiert und die Elongation durch RNA-Polymerase II sowie die chromatinassoziierte Genregulation koordiniert. Parafibromin trägt zur epigenetischen Regulation und zur Steuerung des Zellzyklus bei, indem es Histonmodifikationen und Transkriptionsprogramme beeinflusst, die mit Proliferation und Differenzierung verknüpft sind. Über diese Funktionen hilft CDC73, die genomische Stabilität und eine ausgewogene Transkriptionsleistung in unterschiedlichen Signalkontexten aufrechtzuerhalten, einschließlich Signalwegen, die mit der Wnt/β‑Catenin-abhängigen Genexpression verknüpft sind. Eine Störung der CDC73-Funktion ist mit endokrinen und insbesondere nebenschilddrüsenbezogenen Neoplasien sowie einer weiter gefassten Fehlregulation der Wachstumskontrolle assoziiert, was CDC73 zu einem wertvollen Ziel für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und der Transkriptionsregulation macht.

Parafibromin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDC73-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Parafibromin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDC73-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDC73-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Parafibromin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDC73-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Parafibromin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Parafibromin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDC73-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.