Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAR-2: sc-400333-ACT

F2RL1 code le récepteur activé par les protéases de type 2 (PAR-2), un récepteur couplé aux protéines G activé par le clivage par des protéases à sérine, qui dévoile un ligand « tethered » (lié) et déclenche ainsi une signalisation intracellulaire. PAR-2 se couple à Gαq/11, Gαi/o et Gα12/13 pour réguler l’axe phospholipase C–flux de Ca2+, le remodelage du cytosquelette via RhoA, les cascades MAPK/ERK et la transcription dépendante de NF-κB, façonnant ainsi les réponses inflammatoires et de barrière. Ce récepteur est largement exprimé dans les compartiments épithéliaux et endothéliaux ainsi que dans les cellules immunitaires, reliant l’activité protéasique extracellulaire à la libération de cytokines, au trafic leucocytaire et à la signalisation nociceptive. Une signalisation PAR-2 dérégulée a été impliquée dans l’inflammation chronique, la fibrose, l’hyperréactivité des voies aériennes, le prurit et le remodelage du microenvironnement tumoral, ce qui en fait une cible utile pour des études mécanistiques des voies dépendantes des protéases.

PAR-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de F2RL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAR-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus F2RL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription F2RL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAR-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus F2RL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAR-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAR-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de F2RL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.