Plasmide CRISPR d'Activation (h) p70 S6 kinase/S6K1: sc-400162-ACT

RPS6KB1 code la kinase p70 S6 (S6K1), une kinase sérine/thréonine située en aval de la signalisation PI3K–AKT–mTOR, qui régule la synthèse protéique, la croissance cellulaire et l’homéostasie métabolique. S6K1 phosphoryle la protéine ribosomique S6 ainsi que d’autres substrats qui coordonnent la traduction des ARNm, la biogenèse des ribosomes et le contrôle par rétroaction de la signalisation de l’insuline et des facteurs de croissance. En intégrant les signaux nutritifs et mitogènes, RPS6KB1 contribue à la progression du cycle cellulaire, à la survie et à des programmes de traduction adaptatifs au stress. Une activité mTOR–S6K1 dérégulée est fréquemment étudiée dans des contextes de signalisation oncogénique, de troubles métaboliques et de reprogrammation des voies de croissance associée à la résistance.

p70 S6 kinase/S6K1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RPS6KB1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

p70 S6 kinase/S6K1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RPS6KB1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RPS6KB1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de p70 S6 kinase/S6K1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RPS6KB1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de p70 S6 kinase/S6K1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie p70 S6 kinase/S6K1 dans les cellules tumorales présentant une expression de RPS6KB1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.