p115 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403918-ACT

USO1 kodiert den Vesikel-Tethering-Faktor p115, ein konserviertes Coiled-Coil-Protein, das den Transport vom ER zum Golgi sowie den intra-Golgi-Transport koordiniert, indem es Vesikelhüllen mit Komponenten der Golgi-Matrix und der SNARE-Maschinerie überbrückt. p115 trägt zur Aufrechterhaltung der Golgi-Struktur, des gerichteten Membranverkehrs und der Homöostase des sekretorischen Weges bei und beeinflusst dadurch die Proteinverarbeitung und den Transport zur Zelloberfläche. Störungen des USO1-abhängigen Transports können die Proteostase, Stressantworten und Signalwege beeinträchtigen, die auf regulierter Sekretion und dem Turnover von Membranrezeptoren beruhen. Fehlregulierter Vesikeltransport und eine gestörte Golgi-Organisation sind häufig mit onkogener Transformation und neurodegenerativen Phänotypen assoziiert, wodurch USO1 ein hilfreicher Knotenpunkt ist, um die Folgen sekretorischer Dysfunktion auf Signalweg-Ebene zu untersuchen.

p115 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen USO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

p115 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des USO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der USO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen p115-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native USO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von p115-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des p115-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem USO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.