Ox40 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423560-ACT

Das murine Gen **Tnfrsf4** kodiert **OX40 (CD134)**, einen induzierbaren kostimulatorischen Rezeptor der TNFR-Superfamilie, der vor allem auf aktivierten T‑Zellen und auf Subpopulationen regulatorischer T‑Zellen exprimiert wird. Die Bindung von OX40 durch **OX40L** fördert klonale Expansion, Überleben und Effektor-Differenzierung über **TRAF**-abhängige Signalwege, die in **NF‑κB**-, **MAPK**- und **PI3K–AKT**-Signalachsen zusammenlaufen und so die Zytokinproduktion sowie die Bildung von Gedächtniszellen unterstützen. Eine fehlregulierte OX40-Signalgebung ist an entzündlichen und autoimmunen Prozessen beteiligt und prägt das Immunmilieu von Tumoren, indem sie die Persistenz von T‑Zellen und suppressive Netzwerke beeinflusst. Daher wird **Tnfrsf4** in Maus-Krankheitsmodellen breit untersucht, u. a. im Kontext von Aktivierungsschwellen von T‑Zellen, der Unterstützung von Keimzentren und der Umgestaltung des immunologischen Mikromilieus.

Ox40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tnfrsf4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ox40 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tnfrsf4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tnfrsf4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ox40-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tnfrsf4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ox40-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ox40-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tnfrsf4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.