Plasmide CRISPR d'Activation (h) OPLAH: sc-411939-ACT

OPLAH code la 5‑oxoprolinase, une enzyme cytosolique qui convertit le 5‑oxoproline (pyroglutamate) en L‑glutamate lors d’une étape dépendante de l’ATP du cycle γ‑glutamyl. Par cette réaction, OPLAH contribue au renouvellement du glutathion, à l’homéostasie rédox cellulaire et au métabolisme des acides aminés, reliant les réponses au stress oxydant aux flux métaboliques mitochondriaux et cytosoliques. Une activité altérée d’OPLAH peut perturber la prise en charge du 5‑oxoproline et la disponibilité du glutamate, des processus pertinents pour les phénotypes de stress métabolique et les états de déséquilibre rédox. Comme le cycle γ‑glutamyl interfère avec les voies de détoxification et la capacité antioxydante, la régulation d’OPLAH suscite un intérêt dans les études portant sur les lésions oxydatives, le métabolisme associé à l’inflammation et la signalisation neurométabolique.

OPLAH Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de OPLAH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

OPLAH Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus OPLAH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription OPLAH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de OPLAH. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus OPLAH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de OPLAH au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie OPLAH dans les cellules tumorales présentant une expression de OPLAH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.