OPA1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-428749-ACT

Opa1 de camundongo codifica a GTPase mitocondrial do tipo dinamina OPA1, um regulador central da fusão da membrana mitocondrial interna e da arquitetura das cristas. Ao controlar a integridade das junções das cristas, a OPA1 ajuda a ajustar a eficiência da fosforilação oxidativa, a manutenção do DNA mitocondrial e a compartimentalização do citocromo c, influenciando assim a suscetibilidade à apoptose intrínseca. A função de OPA1 está intimamente ligada às vias de controle de qualidade mitocondrial, incluindo o processamento proteolítico dependente de OMA1/YME1L, que equilibra as isoformas longas e curtas de OPA1 durante o estresse. Alterações na atividade de OPA1 são amplamente usadas como ponto de entrada mecanístico para estudar fenótipos de disfunção mitocondrial relevantes para neurodegeneração, neuropatia óptica e modelos de estresse cardiometabólico.

OPA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Opa1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

OPA1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Opa1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Opa1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de OPA1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Opa1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de OPA1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via OPA1 em células tumorais com expressão de Opa1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.